超敏版人肿瘤坏死因子α(TNF-α) 酶联免疫吸附测定试剂盒

超敏版人肿瘤坏死因子α(TNF-α) 酶联免疫吸附测定试剂盒

肿瘤坏死因子α（ TNF-α) 简介：

肿瘤坏死因子α（ TNF-α) 由中性粒细胞、活化的淋巴细胞、 巨噬细胞、NK 细胞、LAK细胞、星形胶质细胞内皮细胞、平滑肌细胞和一些转化细胞产生。 小鼠TNF-α以膜锚定的形式出现。 自然发生的TNF-α形式是糖基化的 ，但非 糖基化的重组TNF-α具有相当的生物活性。人类和鼠类的TNF-α在氨基酸水 平上显示出大约79%的同源性。

实验原理：

本试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ ELISA） 。往预先包被有人 肿瘤坏死因子α(TNF-α)捕获抗体的微孔中，依次加入样本、标准品、生物素标 记的检测抗体 ，HRP酶结合物 ， 中间经过温育和洗涤 ， 用底物TMB显色 ， TMB在过氧化物酶(HRP)的催化下转化成蓝色 ，并在酸的作用下转化成最终的 黄色。颜色的深浅和样本中的人肿瘤坏死因子α(TNF-α)呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（ OD值） ，计算样本浓度。

灵敏度：7.65pg/mL

特异性：可检测样本中人的TNF-α , 且与其类似物无明显交叉反应。

检测范围：15.62-1000pg/mL

样本稀释：

请提前预估样本的浓度范围 ，如果您的检测样本需要稀释 ，参考稀释方案如下：

稀释 100 倍：一步稀释。取 5μL 样本到 495μL 通用稀释液内 ，做 100 倍稀释；

稀释 1000 倍 ：两步稀释。取 5μL 样本到 95μL 通用稀释液内 ，做 20 倍稀释 ， 再取 5μL 20 倍稀释样本到 245μL 通用稀释液内 ， 做 50 倍稀释 ， 总共稀释 1000 倍；

稀释 100000 倍 ：三步稀释。取 5μL 样本到 195μL 通用稀释液内 ，做 40 倍稀 释 ，再取 5μL 40 倍稀释样本到 245μL 通用稀释液内 ，做 50 倍稀释 ，最后取 5 μL 2000 倍稀释样本到 245μL 通用稀释液内 ，做 50 倍稀释 ，总共稀释 100000 倍；每步稀释时取液量不少于3μL，稀释倍数不超过100倍。每步稀释都需混合均匀，避免起泡。

1. 从室温平衡10分钟后的铝箔袋中取出所需板条 ，剩余板条用自封袋密封 放回4℃。

2. 加样 ：分别将样本或不同浓度标准品按照100μL每孔加入相应孔中 ，空 白孔加入100μL通用稀释液。盖上封板膜后37℃温育60分钟。（建议：

将待测样本用通用稀释液稀释1倍后再加入酶标板内测试。从而减 少基质效应对测试结果的影响 ，最后计算样本浓度时需乘以对应的稀释 倍数。所有的待测样本和标准品在检测中建议设立复孔）。

3. 加生物素化检抗 ：取出酶标板 ，弃去液体 ，不用洗涤。每孔直接加入

100μL生物素化检抗工作液 ，盖上封板膜后37℃温育60分钟。

4. 洗板 ：弃去液体 ，每孔加入300μL 1x洗涤液 ，静置1分钟 ，甩去洗涤液， 吸水纸上拍干 ，如此重复洗板3次（也可用洗板机洗板）。

5. 加酶结合物工作液 ：每孔加入100μL酶结合物工作液 ，盖上封板膜后 37℃温育30分钟。

6. 洗板 ：弃去液体按步骤4洗涤方法 ，洗板5次。

7. 加底物 ：每孔加入90μL底物(TMB) ，盖上封板膜 ，37℃避光温育15分钟。

8. 加终止液 ：取出酶标板 ，每孔直接加入50μL终止液 ，立即在450nm波长 处测定各孔的OD值。

结果判断：

1.计算标准品和样本复孔的平均OD值并减去空白孔的OD值作为校正值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在双对数坐标纸上绘出四参数逻辑函数的标准曲线。

2.若样本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测并在计算样本浓度时乘以相应的稀释倍数。

典型数据和参考曲线：

以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。

注意：本图仅供参考，应以每次实验数据所绘制标准曲线计算样本含量。

1.重复性：板内变异系数小于10%，板间变异系数小于10%。

2.回收率：在选取的健康人血清、血浆和细胞培养上清中加入3个不同浓度水平的人TNF-α, 计算回收率。

3.线性稀释：分别在选取的4份健康人血清、血浆和细胞培养上清中加入

高浓度人TNF-α, 在标准曲线动力学范围内进行稀释，评估线性。